Итак, вернемся к кишечнику, то есть к населяющим его микроорганизмам. По современным представлениям они являются основными переработчиками потребляемой человеком пищи в молекулярную форму. Только в таком виде она может быть доставлена посредством всасывания на кишечной стенке в кровь и далее в клетки тела. Кроме того, микробы синтезируют в своих клетках множество необходимых человеку веществ – витаминов, ферментов, незаменимых аминокислот и других. От стабильности этого процесса и зависит здоровье, следовательно - тонус и качество жизни человека. Как отмечалось, для
контроля и управления микробиотой кишечника необходим количественный метод анализа ее состава, и он получен в виде опосредованного определения ее состава по данным масс-спектрометрии жирных кислот. При использовании этого метода накоплена информация по пристеночной микрофлоре тощей, подвздошной и ободочной кишок путем ГХ-МС анализа микробных маркеров в биоптатах, получаемых в отделениии патологии тонкого кишечника ЦНИИГ, возглавляемом профессором Пафеновым А.И., при исследованиях здоровых добровольцев и больных с синдромом раздраженного кишечника и антибиотико-ассоциированной диареей. Эти исследования впервые позволили установить характер распределения микроорганизмов по отделам кишечника. Их сопоставление с анализом фекалий у тех же пациентов показали, что адекватно динамике заболевания и лечения пробиотиками меняется только пристеночная микробиота. Микрофлора фекалий каких-либо корреляций с процессом не обнаруживает.
Нам удалось измерить концентрацию микробных компонентов непосредственно в месте обитания, где присутствуют сами клетки микробов кишечной стенки. Поэтому мы вправе делать прямые доступные нам сопоставления между концентрацией маркеров и числом микробных клеток в условиях отсутствия пищевой липидной компоненты, поскольку биоптаты получали натощак. Такая логика убеждает нас в том, что мы измерили ведущую микрофлору кишечной стенки. Ведущую в количественном отношении, так как оказалось, что при наличии биоптата весом 4мг мы можем детектировать микроорганизмы начиная с концентрации 10 4
- 10 5 кл/г, поэтому, значительная часть микрофлоры осталась вне поля наших возможностей. Как оказалось, общая численность микроорганизмов кишечной стенки в норме имеет величину в пределах (0,5-1,3)х10 11 кл/г в зависимости от отдела кишечника.
Плотность заселения стенки кишечника в дистальном направлении меняется мало: в подвздошной кишке она в два раза меньше, а в толстой в полтора раза больше, чем в тощей. Измеренная нами пристеночная микрофлора оказалась существенно более концентрированной, чем просветная (по литературным данным [Schaechter, 1993]), которая в тонкой кишке на шесть а в подвздошной кишке на пять порядков ниже по численности (до 10 5 – 10 6 кл/мл соответственно), и только в ободочной кишке соответствует таковой в ее содержимом. Видовой состав микроорганизмов соответствует известным представлениям о компонентах кишечной микрофлоры, в особенности – микроорганизмов фекалий [24]. Однако сходство ограничивается категориями общего характера: качественного состава и приоритетного (рангового) содержания основных элементов кишечного микробиоценоза. Действительно, в толстом кишечнике и фекалиях существенно больше анаэробов.
Полученная нами общая численность микроорганизмов для фекалий находится в пределах интервала значений 0,6-5´ 10 11 кл/г, что согласуется с известными литературными данными измерений генетическим и культурально-биохимическим методами. Совпадает с известными оценками и относительное количество анаэробов в них, которое по нашим данным составляет 88%. Родовое распределение трудно сравнивать с литературными данными, так как в них приводится очень широкий диапазон значений, - в пределах 3-6 порядков. Тем не менее, совпадает наша оценка о приоритете рода Eubacterium, численность которых имеет порядок 10 11 кл/г (10 9 – 10 12 по литературным данным), о количестве бактероидов 10 10 кл/г (10 10 - 10 12 по известным данным), клостридий - 6 х 10 10 кл/г (10 5 - 10 11 соответственно), бифидобактерий 10 10 кл/г (10 10 - 10 12 ), а также по энтерококкам, энтеробактериям, лактобациллам и стафилококкам.
Результаты разных исследований микробиоты фекалий отводят бифидобактериям в их составе почти от 100% до 0,1% (табл. 1). Диапазон в три порядка вряд ли вызван тем, что люди разные, - в каждом исследовании приводится серьезная статистика и добросовестная аналитическая процедура. Разницу следует, скорее, отнести к особенностям сопоставляемых методов количественных измерений. Не вдаваясь в детали, можно заключить, что эффект доминирования бифидобактерий создает рутинная практика анализа только бифидобактерий и условно-патогенной микрофлоры при исследованиях дисбактериозов. Как видно из поля зрения микробиолога при этом выпадают эубактерии, бактероиды и клостридии, которых в фекалиях по современным оценкам по крайней мере в несколько раз больше, чем бифидобактерий. Это заблуждение выглядит естественным, если вспомнить, что в рамках общей микробиологии принято считать, что в микробном сообществе в среднем культивируемыми являются не более 20% микроорганизмов любого местообитания. Что касается фекалий, то по оценкам молекулярно-генетическими методами так же оказывается, что определение 60-80% их микробиоценоза не доступно для культуральных методов. Данные масс-спектрометрии коррелируют с генетическими
(в рамках сопоставимости микробиологических количественных измерений) и одинаково показывают, что эубактерий, бактероидов и клостридий вместе и по отдельности на порядок больше, чем бифидобактерий.
Применение масс-спектрометрического метода дало возможность измерить численность более 50 таксонов микроорганизмов кишечника не только в фекалиях, но и в отделах самого кишечника, путем анализа их маркеров (жирных кислот) непосредственно в биоптатах, полученных при
интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией. Эти данные показывают, что там также доминируют эубактерии, а их видовой состав существенно меняется по длине кишечника. Следует отметить филогенетическое родство эубактерий и клостридий. В определителе Берджи 9-го издания прямо сказано, что род
Eubacterium создан для удобства, чтобы поместить в него слабо спорообразующие клостридии.
Таким образом, кишечная микробиота представляет собой доминирующий континуум штаммов и видов родов
Clostridium и Eubacterium при равновеликом суммарном количестве бактероидов, бифидобактерий и лактобацилл.¡!!!!!!!!!!!!!!!!,
Приведенные данные свидетельствуют о важности рода Eubacterium в формировании и функционировании кишечной микробиоты. Теперь уже трудно, после проведенного анализа филогенетических связей, оторвать его от рода Clostridium (по крайней мере группы C.coccoides) и рассматривать их как пищеварительно важную группу пептолитических и целлюлолитических организмов. Следует отметить принципиально важную особенность представителей рода
Eubacterium, заключающуюся в способности образовывать водород. Это ключевое свойство консорциумов микроорганизмов, осуществляющих дайджест органического субстрата при анаэробных процессах в природе (болота), в рубце жвачных и в биотехнологии при анаэробном сбраживании разного рода отходов и получении биогаза. Мукозный слой кишечника человека по существу является аналогичным биореактором. Там идет образование метана, следовательно, работают архебактерии-метаногены, эффективность которых строго зависима от концентрации водорода в системе. В метаногенном сообществе водородные бактерии играют ключевую регуляторную роль еще и благодаря обратной связи процесса продукции и потребления водорода на первичный процесс расщепления углеводов с образованием ацетата. При СРК, как следует из наших измерений, наибольшие изменения претерпевает численность эубактерий, что должно приводить к увеличению концентрации водорода в системе. Действительно, ранее экспериментально показано четырехкратное увеличение концентрации водорода в выдыхаемом воздухе у больных с СРК (King, 1998) и его возвращение в норму при снятии симптомов в результате ограничительной диеты.
Основную долю (от 70% в тощей кишке до 90 в фекалиях) микроорганизмов во всех отделах кишечника составляют анаэробы. Второе место по численности в тощей кишке занимают аэробные актиномицеты – 17% (в фекалиях их всего 0,7 %). Аэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки) и коринеформные бактерии) – составляют 5% колонизации тонкого кишечника по сравнению с 0,7 % в фекалиях. Доля энтеробактерий и энтерококков по отделам кишечника и в фекалиях близка к 2%.
Неожиданным результатом, несомненно, является обнаружение значительного количества аэробных актиномицетов. Специфичность их маркеров - разветвленных жирных кислот с метильной группой в положении Δ10 не позволяет предполагать какие-либо иные таксономические группы микроорганизмов, кроме представителей порядка Actinomycetales, содержащих в составе клеточной стенки миколовые кислоты, являющиеся источником 10Ме-разветвленных ЖК. Они содержаться в микобактериях, нокардиях, родокках, видах
Actinomadura и других актиномицетах, но не найдены у высших организмов (грибов, растений, животных). Присутствие этих молекул в биоптатах кишечника, крови и других органах и жидкостях человека подтверждается масс-спектрами, а также их анализом в составе музейных культур соответствующих микроорганизмов. Бактерии родов Streptomyces и Nocardiopsis
подтверждены также уникальным маркером изо-гексадекановой кислотой (i16). Кроме того, Nocardiopsis dassonvilley выделен нами в чистой культуре из кишечника.
К ним следует добавить микроорганизмы: Propionibacterium,
Actinomyces, Brevibacterium, которые также выделены в чистой культуре и коринеформные бактерии. Наконец, если учесть, что до настоящего времени в некоторых руководствах по микробиологии, как и ранее [Bergi, 8-th Ed.], род Bifidobacterium
относят к семейству Actinomycetaceae, то окажется, что актиномицеты филогенетически близки традиционно известным представителям пристеночной микробиоты кишечника. Они повышают значимость микробиоты кишечника для организма хозяина, так как актиномицеты превосходят все прочие микроорганизмы по продукции антибиотиков и витаминов и обладают мощным ферментативным аппаратом. Высокая степень колонизации кишечника актиномицетами не выглядит необычным явлением, если иметь в виду, что они широко распространены в окружающей среде – почве, воде, воздухе, на внутренних стенах жилых и производственных помещений [Andersen, 1998]. Их обитание в организме человека при таких обстоятельствах выглядит естественным. Действительно, в руководствах по клинической микробиологии отмечается обнаружение актиномицетов и родственных организмов, таких как
Mycobacterium, Actinomadura, Propionibacterium,
Actinomyces, Corynebacterium, Bifidobacterium в кишечнике и других органах человека. Там они фигурируют (в том числе и бифидобактерии) как участники инфекционных и воспалительных процессов (Mannual on Clinical
Microbiology). Однако патогенность актиномицетов, чувствительность к антибиотикам, способы лечения связанных с ними заболеваний являются предметом
единичных специализированных лабораторий и клиник в мире. Трудности в их бактериальной диагностике и культивировании послужили препятствием широкой известности этих микроорганизмов в клинической практике. В том числе при многочисленных заболеваниях, связанных с изменением микробиоты кишечника и кожи
Существенный вывод для практики диагностики и мониторинга пристеночной микробиоты кишечника дало одновременное определение концентрации микробных маркеров в крови тех же пациентов. Оказалось, что их концентрация коррелирует с концентрацией микробов на кишечной стенке, измеренной в биоптатах. Это физиологически закономерно, так как при естественной гибели микробных клеток их липиды разбираются ферментной системой кишечника, при этом не использованные на его стенке жирные кислоты микроорганизмов поступают в кроветок.
Это явление дает возможность контролировать состояние микробиоты кишечника по данным анализа микробных жирных кислот в капле крови (40 мкл) из пальца.
Следует лишь учесть, что в кровь попадают также микробные молекулы от микроорганизмов, обитающих на других слизистых оболочках человека (ротоглотка, урогенитальный тракт), а также из очагов воспаления, вызванных индигенной (собственной) микрофлорой или возбудилем, поступившим извне. Наличие маркеров микроорганизмов такого происхождения в крови теоретически обусловлено механизмом иммунного ответа на появление возбудителя. Фагоцитирующие клетки организма человека адсорбируют и переваривают антигены микроорганизмов, в том числе и целые клетки, и выводят продукты лизиса в поток лимфатической и кровеносной систем. Кроме фагоцитоза, клетки микроорганизмов разрушаются под действием других механизмов, в том числе собственного апоптоза и лизиса ферментами белкового комплемента крови и других компонентов иммунной защиты. В любом случае разрушение происходит в конечном счете до мономерных составляющих биополимеров. Исходя из основ физиологии обмена биологических жидкостей человека [Физиология человека, М. Мир, 1996], обмен 70% жидкости плазмы с интерстиционным пространством происходит за 1 мин. Поэтому малые фрагменты микробных биополимеров, образующиеся в этом пространстве, поступают в кровь практически сразу. То есть наличие микробных маркеров в крови отражает состав микробных сообществ тела человека, независимо от места обитания микроорганизмов или очага воспаления.
Иначе говоря, измеряя концентрацию микробных маркеров в крови можно оценивать микроэкологический статус человека в целом.
Однако в норме, то есть при отсутствии симптомов воспаления или локального инфицирования, их преимущественным источником является микрофлора кишечника.